Conociendo las propiedades biológicas del veneno de la serpiente cascabel de cola negra
En el mundo se han identificado más de cien mil especies de animales que son capaces de producir veneno, que lo utilizan eficazmente para su defensa y depredación. Los venenos están conformados por más de cien moléculas diferentes; entre ellas existen compuestos farmacológicamente activos como proteínas, péptidos, enzimas con actividades biológicas específicas, carbohidratos, lípidos, iones metálicos y algunas sustancias aún no identificadas.
La mordedura de animales como las serpientes puede provocar envenenamiento agudo y la muerte de la víctima (El-Aziz et al., 2019). Entre las serpientes venenosas destacan las del género Crotalus o de cascabel, cuyo veneno puede ser mortal si no se recibe un tratamiento médico oportuno. En el estado de Sonora existen identificadas 12 especies de serpiente de cascabel y se reportan más de cien mordeduras al año en humanos (Jiménez-Canale et al., 2022). Una de las serpientes de mayor interés es la cascabel cola negra (Crotalus molossus), debido a que su veneno puede causar hemorragias y destrucción de los tejidos (Dobson et al., 2018).
Los venenos son sustancias nocivas para la salud humana, pero se ha demostrado que algunos de ellos tienen potencial para uso médico, como se comprobó en el estudio realizado recientemente por Jiménez-Canale (2024), en el que el veneno de C. molossus demostró tener un efecto citotóxico sobre células de cáncer de mama T-47D. Sin embargo, para su utilización como anticancerígeno debe determinarse específicamente cuáles son los componentes del veneno responsables de dicha actividad.
Por ello, como parte de la tesis de maestría en ciencias realizada en el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD) por el biólogo Raúl Antonio Hernández Acosta, se planteó como uno de los principales objetivos de la investigación analizar las distintas actividades biológicas de los componentes del veneno de C. molossus y de sus fracciones para producir hemólisis, coagular el plasma y digerir proteínas, ya que más del 90% del peso seco del veneno se compone de proteínas (Oliveira et al., 2022; Tasoulis e Isbister, 2017).
Trabajo de laboratorio
El profesor José Ángel Huerta Ocampo, investigador titular de la Coordinación de Ciencia de los Alimentos del CIAD, fue quien dirigió dicha investigación, en la que se fraccionó el veneno de la serpiente mediante técnicas cromatográficas de fase reversa y de intercambio catiónico (basada en la hidrofobicidad y las cargas de sus componentes, respectivamente). Cada una de las fracciones obtenidas del veneno se analizó cualitativamente mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE 13%).
Posteriormente, se analizaron los efectos biológicos como la capacidad para coagular el plasma (coagulación), destruir los glóbulos rojos (hemólisis) y descomponer las proteínas (proteólisis). Para estas pruebas se utilizaron las fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio catiónico eluidas con diferentes concentraciones de acetato de sodio (250, 375, 500 y 2000 mM), así como la fracción no retenida por la columna.
Para la prueba de la actividad coagulante se mezcló veneno de C. molossus diluido con plasma sanguíneo y se registró el tiempo en el que se produjo el primer coágulo. La prueba se repitió para cada una de las fracciones y se calculó la dosis coagulante mínima de veneno necesaria para formar un coágulo al minuto (DCM).
Con el fin de determinar la actividad hemolítica, se utilizaron placas Petri con agar-sangre donde se hicieron perforaciones para aplicar alícuotas de veneno total y de sus fracciones; las placas se incubaron por 24 h a 37 °C. Posteriormente, se midieron los halos formados, que indicaron el grado de destrucción de los glóbulos rojos, reportándose como unidades de hemólisis directa (UHD), según la fórmula descrita por Macías-Rodríguez et al.(2014).
Otra de las pruebas evaluadas fue la capacidad proteolítica del veneno y sus fracciones, esta se realizó en líquido y en gel, utilizando el método de Lomonte y Gutiérrez (1983) con algunas modificaciones. Se mezcló en tubos veneno (que contiene proteasas) con una proteína (caseína) y se incubó la reacción durante 10 min, posteriormente esta reacción se frenó con ácido tricloroacético (TCA). Se compararon las muestras con el control utilizando un espectrofotómetro a 280 nm, obteniendo las U/mg de actividad proteolítica en líquido, según la fórmula establecida para este análisis. Para la prueba en gel se mezcló el veneno con caseína y se incubó por 3 h a una temperatura de 37 °C, permitiendo que las proteasas presentes en el veneno degradaran la caseína; luego la muestra se calentó para detener la reacción y posteriormente se analizó en SDS-PAGE al 13%.
Hallazgos
Se requirieron 86 μg del veneno total de C. molossus para formar un coágulo al minuto (DCM), mientras que en la mayoría de sus fracciones se obtuvo una mayor actividad coagulante con dosis menores, a excepción de la fracción eluida con la mayor concentración de acetato de sodio (2000 mM). Además, se observó que la fracción del veneno no retenida por la columna de intercambio catiónico no mostró actividad coagulante.
El veneno total de C. molossus tiene baja actividad hemolítica (4 UHD); sin embargo, todas sus fracciones tuvieron una mayor actividad, llegando a 16 UHD en la fracción eluida con 375 mM de acetato de sodio. Mientras que la fracción no retenida por la columna no fue capaz de destruir los glóbulos rojos de la sangre.
Finalmente, las pruebas de actividad proteolítica indicaron que el veneno total de C. molossus tuvo una alta actividad (120 U/mg). Todas las fracciones también presentaron actividad proteolítica y las que fueron eluidas con 250 y 500 mM de acetato de sodio superaron la capacidad proteolítica del veneno total (146 y 157 U/mg, respectivamente). La fracción eluida con mayor cantidad de acetato de sodio (2000 mM) mostró la actividad proteolítica más baja (48 U/mg) en la prueba en líquido, aun cuando mostró una mayor actividad en la prueba en gel.
El veneno total de C. molossus presentó una baja capacidad para coagular el plasma y romper los glóbulos rojos, pero una alta actividad proteolítica en comparación con los venenos de otras serpientes. Las diferencias observadas entre el veneno total y sus fracciones se deben a la composición de cada una, ya que pueden contener proteínas que aumenten o disminuyan las actividades biológicas. Las proteínas de la fracción no retenida en la columna no mostraron actividad hemolítica ni coagulante, por lo que se considera que esta fracción pudiera contener inhibidores de dichas actividades biológicas, y esa característica podría ser aprovechada en el futuro para su uso en la farmacéutica; posiblemente esta fracción contenga proteínas similares a la batroxobina, que es una proteína presente en el veneno de serpientes y que actualmente es utilizada para tratar trombosis e infartos al miocardio (Flores-Sánchez et al., 2009; Sun y Bao, 2010; You et al., 2004). De manera contraria, las fracciones del veneno de la serpiente de cascabel de cola negra con mayor actividad proteolítica podrían contener componentes con capacidad citotóxica sobre células de cáncer de mama T-47D.
La cromatografía de intercambio catiónico demostró ser un método eficiente para fraccionar el veneno de C. molossus y analizar las actividades biológicas de sus proteínas. Seguir trabajando con este método permitirá analizar otras actividades con potencial uso médico, como la actividad de la fosfolipasa, neurotóxica y anti-proliferativa de células cancerosas.
Es importante identificar específicamente qué componente de cada fracción es responsable de cierta actividad con potencial farmacéutico. Por ello, se recomienda usar técnicas más especializadas, como la cromatografía de líquidos de ultradesempeño acoplada a espectrometría de masas en tándem (UPLC-MS/MS), para identificar las proteínas presentes en cada fracción. Además, sería interesante estudiar el potencial farmacéutico de los metabolitos presentes en el veneno, ya que, aunque más del 90% del peso seco del veneno de serpiente está compuesto por proteínas que son las responsables de sus principales efectos, también se han identificado metabolitos con potencial farmacéutico; tal es el caso del captopril, utilizado para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares como la hipertensión o la insuficiencia cardiaca (Péterfi et al., 2019).
Referencias
Dobson, J., Yang, D. C., Op den Brouw, B., Cochran, C., Huynh, T., Kurrupu, S., Sánchez, E. E., Massey, D. J., Baumann, K., Jackson, T. N. W., Nouwens, A., Josh, P., Neri-Castro, E., Alagón, A., Hodgson, W. C. y Fry, B., G. (2018). Rattling the border wall: pathophysiological implications of functional and proteomic venom variation between Mexican and US subspecies of the desert rattlesnake Crotalus scutulatus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 205: 62-69.
El-Aziz, T. M., Garcia, S. A. y Stockand, J. D. (2019). Snake venoms in drug discovery: valuable therapeutic tools for life saving. Toxins, 11: 564-589.
Flores-Sánchez, E. (2009). Snake venom proteinases that affect coagulation and fibrinolysis. Animal Toxins: State of the Art Perspectives in Health and Biotechnology. 575-588.
Jiménez-Canale, J., Velázquez-Contreras, E. F. y Sarabia-Sainz, J. A. (2022). El potencial farmacológico de venenos de serpientes de Sonora, México. Epistemus, 16(33): 84-92.
Jiménez-Canale, J., Navarro-López, R., Huerta-Ocampo, J. A., Burgara-Estrella, A. J., Encarnación-Guevara, S., Silva-Campa, E., Velázquez-Contreras, F. E. y Sarabia-Sainz, J. A. (2024). Exploring the protein profile and biological activity of Crotalus molossus venom against E. coli, P. aeruginosa and S. aureus bacteria and T47D breast carcinoma cells. Toxicon, 249: 108036.
Lomonte, B. y Gutiérrez, J. M. (1983). Proteolytic activity of snake venoms of Costa Rica on casein. Revista de Biología Tropical, 31(1): 37-40.
Macías-Rodríguez, E. F., Díaz-Cárdenas, C. O., Gatica-Colima, A. B. y Plenge-Tellechea, L. F. (2014). Variación estacional del contenido proteico y actividad de la PLA2 del veneno de Crotalus molossus molossus entre especímenes de origen silvestre y en cautiverio. Acta Universitari, 24(1): 38-47.
Péterfi, O., Boda, F., Szabó, Z., Ferencz, E. y Bába, L. (2019). Hypotensive snake venom components-a mini-review. Molecules, 24(15): 1-16.
Oliveira, A. L., Viegas, M. F., Da Silva, S. L., Soares, A. M., Ramos, M. J. y Fernandes, P. A. (2022). The chemistry of snake venom and its medicinal potential. Nature Reviews Chemistry, 6(7): 451-469.
Sun, Q. Y. y Bao, J. (2010). Purification, cloning and characterization of a metalloproteinase from Naja atra venom. Toxicon, 56(8): 1459-1469.
Tasoulis, T. e Isbister, G. K. (2017). A review and database of snake venom proteomes. Toxins, 9(9): 1-23.
You, W. K., Choi, W. S., Koh, Y. S., Shin, H. C., Jang, Y. y Chung, K. H. (2004). Functional characterization of recombinant batroxobin, a snake venom thrombin-like enzyme, expressed from Pichia pastoris. FEBS Letters, 571(1-3): 67-73.
Autores(as): Raúl Antonio Hernández Acosta, egresado de la maestría en ciencias del CIAD; José Ángel Huerta Ocampo, Angelica Espinosa Plascencia, Adriana Teresita Muhlia Almazán, Ana María Guzmán Partida, académicas(os) del CIAD; Esaú Bojórquez Velázquez, investigador del Instituto de Ecología, yJorge Jiménez Canale, investigador de la Universidad de Sonora.
Laboratorio de Proteómica de la Coordinación de Ciencia de los Alimentos del CIAD
Autor de correspondencia: jose.huerta@ciad.mx
